使用CRISPR-Cas9技術對人類T細胞進行編輯

【背景】

T細胞作為人體重要的免疫細胞,對人體的免疫調節起到重要的作用,如果能夠對T細胞的基因組成功進行編輯,那么對癌癥、HIV、免疫缺陷疾病和自身免疫病治療則可以從細胞水平進行治療。目前,CRISPR-Cas9基因編輯技術可以對多種細胞類型的基因組進行編輯,但是對于人類的T細胞還有一定難度,尤其是對T細胞的基因組進行替換性的基因修飾。本文通過優化CRISPR-Cas9技術,預先將Cas9蛋白與sgRNA在體外組裝成Cas9 RNPs,再將Cas9 RNPs轉入到細胞中對基因組進行敲除/敲入。本文成功地完成了對人類CD4+ T細胞中的HIV病毒的共同受體CXCR4蛋白和免疫抑制蛋白PD-1的基因靶點的編輯,經過精確編輯后的人體CD4+ T細胞數量得到增加,因此有望于應用于人體的免疫治療中。這種基于CRISPR RNPs的基因治療方法,可以人為的對天然的T細胞進行特異性改造,為腫瘤、免疫疾病等多種人類重大疾病的治療帶了新的方法和思路。

【方法】

  1. 使用電穿孔的方法將Cas9 RNPs導入到細胞內,敲除人類CD4+ T細胞表面CXCR4基因的外顯子區域(圖1);
  2. Cas9 RNPs轉入人類CD4+ T細胞的實驗流程

  3. 針對CXCR4基因設計單鏈DNA模板用于同源重組修復(圖2),替換原序列中的12個堿基,并加入Hind III酶切位點用于驗證目標序列是否替換成功;
  4. 根據CXCR4基因設計HDR模板

  5. 針對PD-1基因的第一個外顯子設計單鏈DNA模板,替換原序列的12個堿基,并引入了Hind III酶切位點用于后續驗證(圖3)。
  6. 根據PD-1基因設計HDR模板

【結論】

  1. 經過T7E1方法確定Cas9 RNPs可以成功編輯T細胞基因組中的CXCR4基因,從而也對人類CD4+ T細胞中的蛋白表達造成影響。同時,流式細胞儀能夠豐富被編輯過的T細胞的數量,為Cas9 RNP應用于T細胞提供一種有效的工具;
  2. 經過Hind III酶驗證方法得知,基因敲入的目標序列被Hind III酶切割形成2條新的短序列,由此說明Cas9 RNPs結合HDR模板可以精確地對人類T細胞中CXCR4基因和PD-1基因進行替換性的基因修飾(圖4和5);
  3. CXCR4基因修飾后Hind III酶切后凝膠電泳結

  4. 通過體外組裝Cas9 RNPs可以實現對人類CD4+ T細胞有效的基因組編輯,包括對人類CD4+T細胞中CXCR4和PD-1的基因修飾。

CRISPR-Cas9服務訂購

  1. Email:請將您的詳細需求發送到[email protected]
  2. 電話訂購:您可以直接撥打免費熱線4000-973-630轉803聯系我們經驗豐富的工程師
  3. QQ咨詢:任何技術問題均可與我們在線互動,泓迅科技官方企業QQ:4000-973-630
  4. 關注泓迅科技微信公眾號:szhxswkj;按照“姓名+學校/公司名稱+聯系方式”給我們留言,即可免費獲取“CRISPR-Cas9基因編輯技術應用手冊”。

參考文獻

  1. Schumann, K., et al., Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(33): p. 10437-42.