哺乳動物細胞CRISPR-Cas9的基因編輯

【背景】

靶向核酸酶以其高效性成為了介導基因組編輯的強大工具。目前,世界上應用最廣泛的基因編輯工具是從細菌的免疫系統中分離出來的CRISPR-Cas9系統。它是通過sgRNA介導Cas9核酸內切酶對基因組特定的20nt序列進行剪切,并通過非同源末端修復(NHEJ)或同源定向修復(HDR)來實現基因的敲除或敲入(knock-out/in) ,從而對哺乳動物細胞內或改造細胞株的下游功能進行研究。同時為了最大程度的減少脫靶效率,采取了雙切口策略,使用成對的sgRNA介導Cas9核酸內切酶。CRIPSR-Cas9 技術周期短,從靶點設計開始,可以在短至1-2周內實現基因修飾,并且可以在2-3周內得到修飾過的克隆細胞系。CRISPR-Cas9技術可對哺乳動物基因的進行高效精確的敲除和敲入,可廣泛應用于基因功能的后續驗證工作中。

【方法】

  1. sgRNA的設計方案
  2. 推薦使用CRISPR設計工具(//tools.genome-engineering.org)來進行靶位點的選擇(圖1);
    sgRNA設計方案

  3. 構建sgRNA和Cas9表達載體
  4. 根據設計方案構建sgRNA和Cas9載體,同時在Cas9載體中添加GFP或嘌呤霉素抗性基因以幫助后續篩選轉染細胞。分別構建了CRISPR-Cas9的單載體系統和雙載體系統(圖2);
    構建sgRNA和Cas9表達載體

  5. 構建修復模版
  6. 為了實現基因的敲入,需要構建同源模板。同源模板由需要敲入的基因和靶位點兩側的序列組成的兩同源臂構成。通常情況下,修復模板為載體的形式,單側的同源臂長度要超過500bp;為單鏈DNA的形式時,單側的同源臂長度至少要40bp(圖3);
    構建修復模版

  7. 功能驗證
  8. 功能驗證的方法包括Surveyor錯配內切酶檢測法、HindIII酶切位點法及測序方法(圖4)。Surveyor錯配酶可以對異源雙鏈進行切割,并通過凝膠條帶的強度來確定切割DNA的分數,從而計算Cas9的切割效率(Indel百分比)(圖2);在插入的目標基因中插入了HindIII酶切位點可對PCR產物進行切割,同樣通過凝膠條帶的強度來計算Cas9的切割效率(圖3)。
    功能驗證

【結論】

  1. 設計兩個sgRNA同時對人類HEK293FT細胞中的DYRK1A和GRIN2B基因進行敲除,每個位點敲除效率為65~68%(圖5),證明了CRISPR-Cas9能夠簡便且高效的應用于哺乳動物基因組;
  2. 哺乳動物基因編輯

  3. 成對的sgRNA對EMX1基因外顯子進行敲除,可對基因造成微小精確的編輯效果(圖6);
  4. EMX1基因外顯子敲除效率

  5. 基因敲入時設計的修復模板既可以是質粒也可以是單鏈的DNA(ssODN),基因敲入效率最低為0.18%,最高也不過是27%。由此可以得知,基因敲入的效率要遠低于基因敲除的效率(圖7)
  6. 使用質粒和ssOND修復的基因敲入效率

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參考文獻
Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 2013. 8(11): p. 2281-308.