CRISPR-Cas系統在模式植物和農作物中靶向編輯的應用

【背景】

近年來,基于細菌CRISPR-CasⅡ型的出現,幾乎可以替代傳統的基因工程,CRISPR-Cas系統允許個性化的小的非編碼RNA來介導靶標基因組DNA的切割,從而使基因能夠通過非同源末端結合和同源連接的修復機制來修飾基因。該系統基于Cas9核酸酶和靶向核酸序列引導的sgRNA, 只需要單個RNA來產生靶標特異性,CRISPR-Cas系統比ZFNs和TALENs更易應用于基因工程,目前有許多關于CRISPR-Cas9系統在植物基因組編輯中的成功報道[1-8]。

【方法】

  1. CRISPR-Cas9技術已成功應用于模型植物(本氏煙草、擬南芥)和作物(稻、小麥)(圖1);
  2. 植物基因組編輯流程

  3. CRISPR-Cas系統應用于植物的基因編輯實驗
  4. 對植物基因組進行編輯可以使用兩個sgRNA對同一基因兩個位點進行靶定,造成兩個DNA雙鏈斷裂,從而造成基因組大片段缺失。將sgRNA-Cas9載體轉入到植物細胞中通常采用原生質體轉化和農桿菌滲透(采用農桿菌AGL1型)的方法(圖2)。
    敲除煙草PDS基因及AFLP分析

【結論】

  1. 經過驗證,CRIPSR-Cas9在植物中可以進行有效的基因編輯(圖3)。目前已經報道的經過CRISPR-Cas9系統編輯過的植物比例非常高(對于擬南芥高達89%,水稻高達92%)??蒲Ъ頤且捕訡as9的載體構建進行相應的優化,添加標簽或者選擇在不同的物種中選擇合適的啟動子;
  2. Cas9載體優化方案

  3. 在植物中,通常使用植物RNA聚合酶III啟動子(例如U6和U3)表達sgRNA,這些啟動子具有確定的轉錄起始核苷酸,U6和U3,轉錄起始的核苷酸在分別是G和A(圖4)。
  4. sgRNA載體構建

CRISPR-Cas9服務訂購

  1. Email:請將您的詳細需求發送到[email protected]
  2. 電話訂購:您可以直接撥打免費熱線4000-973-630轉803聯系我們經驗豐富的工程師
  3. QQ咨詢:任何技術問題均可與我們在線互動,泓迅科技官方企業QQ:4000-973-630
  4. 關注泓迅科技微信公眾號:szhxswkj;按照“姓名+學校/公司名稱+聯系方式”給我們留言,即可免費獲取“CRISPR-Cas9基因編輯技術應用手冊”。

參考文獻

Belhaj, K., et al., Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods, 2013.9(1): p. 39.